Mol Psychiatry 综述︱阿尔茨海默病人脑内具有生物活性的可溶性淀粉样β蛋白：病理生理学和治疗探讨

撰文︱李少敏

责编︱王思珍

一般认为，阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是淀粉样β蛋白（Aβ）和Tau蛋白的毒性寡聚体累积损伤了神经突触，从而导致认知能力逐渐下降。Aβ的积累比痴呆症的临床症状早几十年，与不溶性淀粉样斑块相比，AD痴呆的严重程度与可溶性Aβ的皮质水平更密切相关。可溶性Aβ寡聚体（soluble oligomers of Aβ，oAβ）在活体动物和脑片中可阻断海马长时程增强（long-term potentiation，LTP，一种与学习和记忆相关的电生理现象），而抗Aβ抗体可以阻止Aβ介导的LTP损伤，并改善APP转基因小鼠的认知缺陷。最近FDA批准的Aducanumab就是抗Aβ的抗体， 因为它可以显著减少淀粉样PET信号并改善认知功能，其它几个3期临床试验的也是针对可溶性Aβ寡聚体开发的。然而绝大多数关于Aβ介导的神经毒性的研究都是用化学合成的Aβ肽, 而用与AD疾病高度相关的人脑组织提取的Aβ研究不多， 这些AD脑提取的Aβ与化学合成的Aβ肽在结构和毒性强度方面不完全相同，因而，用AD病人脑 提取的Aβ研究其损害突触功能的确切机制， 可为AD的治疗提供更有效方法。

2022年4月28日，哈佛医学院布莱根与妇女医院的李少敏教授和Andrew Stern医生受邀在Molecular Psychiatry 上发表了题为“Bioactive human Alzheimer brain soluble Aβ: pathophysiology and therapeutic opportunities”的最新综述文章。该综述对直接从AD患者脑组织中提取的Aβ的特性以及其对突触功能的损害机制进行了解读，并提出了治疗AD的可行性途径， 也为今后的基础研究和临床试验的验证提供了新的方向。 

一、具有生物活性的人脑提取的Aβ的特性

观察人脑中Aβ聚集体的经典方法是使用同源染料或特异性抗体对固定组织进行染色。在这种情况下，在淀粉样斑块中观察到Aβ，主要是致密核心（神经炎）或弥漫性。然而，组织染色仅限于观察相对较大的不溶性结构，缺乏实验灵活性。现代生物学技术允许分析脑组织的液体提取物，其方法是将组织均匀化或浸泡在含有不同性质的化学物质的缓冲液中，在更复杂的缓冲液中提取的Aβ要多得多，这反映了原纤维的基本不溶性聚集状态。然而，水提取物中的Aβ似乎含有生物活性物质，并与病理学密切相关。2008年，作者最早将体积排斥色谱（size exclusion chromatography，SEC）组分别应用于小鼠海马脑片，发现最能抑制LTP或促进长时程压抑（long-term depression，LTD）的组分是含有低分子量（LMW）聚合体的成分，而单体或不溶性斑块则没有明显毒性[1]（图1）。变性斑块释放二聚体也有类似的效果，HMW和毒性更大的LMW聚合体可能处于平衡状态：在大脑中，作者用SEC分离出HMW聚合体，然后让它们在稀释缓冲液中分解。他们发现HMW聚合体转化为LMW聚合体，并且这些LMW聚合体恢复了更大的毒性[2]。

图1 不同Aβ种类介导的海马长时程增强效应示意图

Aβ是多形性的，可以聚集成一系列的组装体，从单体到淀粉样斑块中发现的不溶性~8纳米纤维的聚合体。然而，只有可溶性低分子量低聚合物可以抑制高频刺激（HFS）诱导的海马LTP。单体（~4kD）和斑块衍生的不溶性纤维对海马LTP无显著影响。

（图源：Li S & Stern AM, Mol Psychiatry, 2022）

多项研究表明，与人工合成的oAβ相比，从AD大脑中提取的oAβ是一种更有效的毒素， 其毒性是化学合成Aβ肽的100倍[3,4]，但原因尚不清楚。AD脑的可溶性提取物含有除Aβ本身以外的丰富物质，因此关于oAβ的结论通常依赖于Aβ免疫替代或免疫阻断对照，和/或对照脑与AD脑的比较。最近的电子冷冻显微镜研究已经证明，人脑来源的原纤维与体外产生的原纤维结构完全不同，这表明它们产生的低聚物可能也不同。值得注意的是，AD脑提取物的有生物活性的Aβ与ELISA测定的总Aβ水平并不直接相关[5]，这意味着这些提取物中存在其他突触毒素和/或仅存在一种特殊的毒性oAβ亚群。

综上所述，从人脑中提取的Aβ可溶性寡聚体的描述相对较少，尽管它们与神经原纤维缠结形成和认知障碍的相关性最好。最具生物活性的Aβ低聚物似乎是LMW，与活性较低的HMW形式相平衡，均由主要单体和共价键合二聚体组成。这些低聚物可以损害突触功能，但也会导致Tau过度磷酸化和神经炎完整性丧失。

二、具有生物活性的人脑Aβ突触的病理生理学

在大脑中，神经网络的链接是由突触介导的， 即一个神经元突触前末端的信息通过释放神经递质，神经递质与突触后神经元上各自的受体结合，激活下游信号通路。突触前末端、突触后神经元及其周围的星形胶质细胞形成三重体，在AD的发病机制中起着至关重要的作用。

1. 突触可塑性

谷氨酸是脑内最主要的兴奋性神经递质，也是神经突触信号传递的主要介质。它的主要受体NMDA受体（NMDAR）在与学习和记忆相关的突触可塑性中起着关键作用，AMPA受体（AMPAR）介导谷氨酸能突触的快速神经传递。LTP的表达是由于AMPAR在突触后膜中的插入增加和功能增强，而LTD的表达需要增加这些受体的清除和功能降低。合成的或细胞分泌的oAβ在突触处与NMDAR共定位，并与NMDAR共免疫沉淀，而在NMDAR敲除神经元中，oAβ就不能与含有NMDAR的树突的结合，这表明NMDAR的邻近性在NMDAR调节中起作用。选择性阻断含有GluN2B的NMDAR可恢复[6,7]或逆转[8] oAβ引起的突触抑制。低亲和力NMDAR拮抗剂美金刚在临床使用时，通过选择性阻断突触外NMDAR来拯救Aβ受损的LTP [9]。作者最早证实oAβ干扰了谷氨酸摄取[10]并诱导星形胶质细胞谷氨酸释放[11]，因而增加细胞外谷氨酸浓度并激活更多NMDAR。这些增多的谷氨酸作用于突触外含有GluN2B的受体，并启动突触外信号通路，导致LTP的抑制和LTD的增强，最终导致NMDARs内吞和突触消失。

代谢型谷氨酸受体（mGluRs）介导谷氨酸的缓慢和持久效应，并调节神经元生理学的各个方面，尤其是神经元兴奋性和突触可塑性。AD大脑海马CA1区的mGluR1水平降低。在体外和在体实验中，应用AD脑源性oAβ可通过mGluR1/5激活促进LTD [1,10,12]。mGluR促进LTD可能是由于细胞外谷氨酸水平升高和含GluN2B的NMDAR的磷酸化。oAβ介导的mGluR依赖性LTD可能涉及PERK/eIF2α和eEF2K/eEF2信号通路[13]，表明oAβ可能在翻译起始和延伸水平损害突触功能。

2. 星形细胞机制

星形胶质细胞是大脑中数量最多的细胞类型，在调节神经元周围细胞外离子浓度方面发挥着最重要的作用。星形胶质细胞通过兴奋性氨基酸转运体2型（EAAT2）（或啮齿类动物中的GLT-1）在神经元活动后清除细胞外谷氨酸和限制突触外神经元NMDAR激活中发挥作用。多个研究小组发现，人脑来源和合成的oAβ通过干扰谷氨酸再摄取而损害海马突触可塑性[10,14]。在药理学上，通过谷氨酸摄取抑制剂TBOA增加细胞外谷氨酸水平已被证明会损害LTP并增强海马中的LTD [10]。星形胶质细胞还可通过释放NMDAR共同激动剂D-丝氨酸和甘氨酸来调节突触功能。D-丝氨酸增加，加上细胞外谷氨酸水平升高，可能导致神经元兴奋毒性和死亡。另外，星形胶质细胞NMDAR也可能与AD有关，因为它们可促进谷氨酸兴奋毒性。

3. 活体脑的高度兴奋性

在AD的早期阶段，突触功能障碍是由神经元过度活跃引发的，这与可溶性oAβ在体内外诱导神经元过度兴奋的累积证据一致，也与AD患者无故癫痫发作和亚临床癫痫样活动的发生率更高一致。Zott等人[14]利用CA1区的双光子钙成像检测了暴露于oAβ的活体小鼠的神经元活动。人工合成和AD脑源性Aβ二聚体均能在活体大脑中诱导神经元过度兴奋。用合成的或天然的oAβ在离体海马脑片中诱导高兴奋性需要首先用荷包牡丹碱处理，以将基础活性增加到活体小鼠的水平。这些结果表明oAβ诱导的兴奋性增加具有活动依赖性。另一方面，兴奋性增加可能导致正反馈回路，即突触活动可以在体外和体内调节Aβ的产生。在清醒、癫痫和创伤性脑损伤期间，间质液中的Aβ水平随着突触活动而增加。调节Aβ水平的突触活动机制可能与APP内吞和切割有关。因此，oAβ诱导的兴奋性增加可能反过来导致更多的Aβ释放和兴奋性毒性。

图2 Aβ低聚物介导的突触可塑性效应示意图

当Aβ低聚物应用于培养基、脑切片或完整大脑时，寡聚体会破坏突触功能的多个方面。在突触前，Aβ寡聚体可能会通过直接或间接的方式干扰或调节神经递质的释放①。oAβ还可以与星形胶质细胞结合，刺激D-丝氨酸的释放② 减少星形细胞谷氨酸再摄取③, 因此，增加细胞外谷氨酸浓度④。高浓度的细胞外谷氨酸和D-丝氨酸进一步激活含有NMDA受体的突触外GluN2B⑤， 突触外GluN2B受体的过度激活以及oAβ触发的AMPAR和NMDAR的内吞作用⑥会导致LTP损伤和LTD增强，并对突触产生其它有害影响。

（图源：Li S & Stern AM, Mol Psychiatry, 2022）

三、保护突触免受脑源性Aβ的损害

可溶性oAβ可能导致AD患者的认知功能障碍，使oAβ及其影响途径成为AD治疗的靶点。本文综述了基于oAβ病理生理学的当前和实验治疗方法。

1.  抗Aβ抗体

抗Aβ抗体可以清除作为AD的主要毒素Aβ，因而不少的抗Aβ单克隆抗体（MAB）的都进入了3期临床试验中，这是医务工作者最为认同的治疗方法。FDA加速批准的Aducanumab就是这类药物。据报道，Aducanumab与原纤维Aβ结合的亲和力与Gantenerumab和Bapineuzumab单抗相似，但对可溶性Aβ单体没有亲和力[15]。在临床试验参与者的大脑、脑脊液或血浆中测量oAβ的困难限制了对单克隆抗体清除oAβ的能力的评估。Aβ病理学的一个更广泛使用的标记物是淀粉样PET，它识别Aβ的某些纤维形式，但尚不清楚淀粉样PET测量oAβ水平的效果如何。含有原纤维的斑块可能是AD大脑中扩散性oAβ的主要来源，因此清除斑块可能清除oAβ。最新一代的抗Aβ单抗Aducanumab、Lecanemab [16]和Donanemab [17]显示，与前几代相比，淀粉样PET信号的减少最为强劲，效力信号也最大，但这些抗体（以及Gantenerumab单抗的斑块清除剂量）的验证性试验仍在进行中。更好的测量oAβ的工具，如新的免疫分析或PET探针，可以测量这些抗体的靶参与度。

实验研究表明，抗Aβ治疗可以缓解突触功能障碍。作者使用了几种表位特异性抗体来测试抗Aβ抗体中对抗AD脑Aβ诱导的海马LTP损伤的效能[1,5]。他们发现，以游离Asp1（3D6和82E1）开始的N端抗体可以完全恢复人脑源性oAβ介导的突触功能障碍，而C端抗体（2G3和21F12）则没有作用（图3）。中间区靶向抗体（266、4G8和6E10）的影响较小，但未达到显著水平。这些结果与之前的报道一致，即针对N端而非C端的抗体可以中和Aβ介导的突触毒性，并减少Aβ斑块负荷。N端定向抗体可能会接触到Aβ的低聚物和原纤维，并激活Aβ聚集体的小胶质细胞吞噬作用。

图3-N-末端，而非C-末端特异性抗体，可防止可溶性AD脑Aβ诱导的海马LTP损伤。（A）人类Aβ1-42的氨基酸序列和抗体靶向表位；（B）Asp1 N末端特异性Aβ抗体3D6可防止AD脑TBS提取物抑制的LTP；（C）C端特异性抗体2G3和21F12不能阻止AD脑TBS提取物抑制的LTP。

（图源：Li S & Stern AM, Mol Psychiatry, 2022）

2. 抗谷氨酸兴奋毒性

如上所述，越来越多的证据表明，oAβ可以通过改变突触间的谷氨酸循环，打乱兴奋性/抑制性平衡或干扰神经元细胞膜的特性，导致皮质和海马神经元的高度兴奋性。大脑神经元兴奋性的增高与AD患者在亚临床和临床癫痫发作的频率增加以及Aβ累积的AD小鼠模型的癫痫活动增强一致。FDA批准用于治疗中重度AD的美金刚是一种非选择性NMDAR拮抗剂。美金刚主要防止大脑中的谷氨酰胺能过度激活，也就是AD中的神经兴奋性毒性有关[18]。如上所述，GluN2B-NMDAR拮抗剂可在体外和体内预防oAβ诱导的突触功能障碍和神经毒性，表明开发一种比美金刚更具选择性的GluN2B拮抗剂可能是治疗AD的一种可能方法。

β-内酰胺抗生素头孢曲松是一种脑渗透剂，可以激活谷氨酸转运体GTL-1并清除突触中的谷氨酸。头孢曲松对各种oAβ诱导的突触功能障碍和认知损害具有显著的保护作用。另外，GLT-1激活剂LDN/OSU-0212320和LDN/OSU-0215111也可降低小鼠模型中的Aβ负担，改善突触功能和认知缺陷。因此，通过提高谷氨酸转运体的活性增强谷氨酸清除率以降低oAβ诱导的谷氨酸兴奋毒性可能是另一种治疗方法。

3. 改善突触功能

据报道，突触的消失，而非神经元缺失、Aβ斑块或神经纤维缠结，与AD痴呆症的相关性最强，因为突触是介导神经元通讯和海马学习和记忆功能的主要元素。与标准饲养的小鼠相比，暴露于丰富环境（EE）中的AD小鼠模型在海马依赖性学习和记忆任务上表现更好，这与突触功能的改善相关。作者证明，延长EE可通过激活β2-肾上腺素能受体（β2-AR）信号传导，增强海马突触可塑性，并防止AD脑oAβ引起的LTP损伤[19]。选择性激动剂激活β2-AR可增进突触增强和记忆任务，并防止AD小鼠模型中突触蛋白突触素、突触蛋白1和PSD95的减少，而选择性β2-AR拮抗剂则会加重AD模型小鼠的神经病理学和认知缺陷。最近，激活β2-AR的有益作用受到了更多关注，因为临床和实验研究表明β2-AR激活对唐氏综合征、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症（ALS）和多发性硬化等神经疾病具有保护作用。脑特异性β2-AR激动剂的开发可增强突触对oAβ介导毒性的抵抗力。

综上所述，除了抗淀粉样蛋白免疫治疗外，中和oAβ介导的突触功能障碍可能为AD的治疗靶点提供一种途径。美金刚的经验表明，突触信号的改变是一个可行的靶点。我们已经了解了oAβ如何破坏突触，并且已经确定含有GluN2B的NMDAR、谷氨酸转运体和β2-ARs是有潜力的候选者。也许将这三种靶向与靶向oAβ本身相结合可以最好地防止oAβ介导的突触毒性。

四、总结与展望

AD脑组织中的Aβ物种含有多种形式，但并非所有形式都具有神经毒性。生物活性Aβ物种主要是可溶性低分子量低聚物，具有突触毒性；由于突触功能与AD进展过程中的认知损害密切相关，因此研究Aβ引起突触功能障碍（海马LTP损害和LTD增强）的确切机制可以为AD的预防和治疗提供有价值的信息，在某些情况下，oAβ可以通过多种机制干扰突触功能，这是由于Aβ的多聚体特性决定的。这些机制包括扰乱突触前神经递质释放，干扰突触可塑性期间突触后谷氨酸受体（NMDAR、AMPAR和mGluR）的动力学，以及破坏星形胶质细胞对突触功能的贡献。因此，除了直接中和oAβ外，包括改善这些突触功能缺陷在内的多靶点治疗可能会是治疗AD的最佳途径。无创性脑活动记录，如视觉诱发电位、经颅直流电刺激（tDCS）和重复经颅磁刺激中的LTP样和LTD样变化，或者用人工智能分析高密度脑电图，可能是跟踪AD患者对突触靶向干预的药物反应的有用生物标记物

原文链接：http://doi.org/10.1038/s41380-022-01589-5

李少敏 教授

（照片提供自：哈佛医学院布莱根与妇女医院李少敏实验室） 

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制版︱王思珍

本文完